內(nèi)容大綱
細(xì)胞培養(yǎng)與廢液抽吸
細(xì)胞培養(yǎng)繼代流程
廢液抽吸方法的比較
細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)設(shè)備
廢液處理與廢棄辦法

什么是廢液抽吸？

廢液抽吸 （aspiration / suction） 是現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)中常用的技術(shù)，用以移除細(xì)胞培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)作的廢棄液體。

生物學(xué)中常見(jiàn)的細(xì)胞培養(yǎng)，是將真核或原核細(xì)胞培養(yǎng)于適宜的培養(yǎng)液 （culture medium） 環(huán)境中，使其在受控制的狀態(tài)下生長(zhǎng) （growth） 及增殖 （proliferation）的過(guò)程。 細(xì)胞培養(yǎng)的流程包含解凍細(xì)胞、培養(yǎng) （cell culture）、繼代培養(yǎng) （俗稱(chēng)分盤(pán)，cell subculture） 及冷凍細(xì)胞等步驟。

而在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生代謝物、細(xì)胞碎片等廢棄物影響細(xì)胞健康，甚至導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。 因此在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，需定期更換培養(yǎng)液，而移除舊有培養(yǎng)液、洗滌液的行為，則為廢液抽吸。

真空廢液抽吸裝置 （suction system， aspiration system） 常見(jiàn)如上圖，主要包含：

1. 真空瓶 （vacuum flask）
2. 緩沖瓶 （safety bottle）
3. 過(guò)濾器（filter）
4. 真空源 （vacuum source）：如真空泵。

連接并啟動(dòng)真空泵后，細(xì)胞培養(yǎng)瓶/皿中的廢液會(huì)因壓力差而被抽吸、收集至真空瓶，緩沖瓶則做為防溢裝置使用，以避免廢液被抽吸至真空源內(nèi)。 過(guò)濾器可使用HEPA濾膜（High Efficiency Particulate Air filter 或 0.22 μm過(guò)濾器，以過(guò)濾掉廢液及空氣中的粒子、確保抽吸的效率。

細(xì)胞培養(yǎng)繼代流程

▲ 細(xì)胞培養(yǎng)前，請(qǐng)確認(rèn)作環(huán)境符合無(wú)菌作條件，且應(yīng)避免和細(xì)菌實(shí)驗(yàn)共享設(shè)備，以防污染。

1. 解凍細(xì)胞 （thawing cells）：將冷凍細(xì)胞以 37 oC 快速解凍、回溫，以避免細(xì)胞損傷。
2. 培養(yǎng) （cell culture）：依據(jù)細(xì)胞種類(lèi)和濃度，將細(xì)胞和培養(yǎng)基均勻混合后，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3. 繼代培養(yǎng) （cell subculture）：當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至一定程度后，收集細(xì)胞，分殖于新的培養(yǎng)基中。
   進(jìn)行繼代培養(yǎng)時(shí)，其依細(xì)胞種類(lèi)不同，處理方式可分為以下兩大類(lèi)：

   a. 附著型細(xì)胞 （adherent cell），又稱(chēng)貼壁培養(yǎng)、單層培養(yǎng) （monolayer culture）
   

   1. 去除舊培養(yǎng)基廢液
   2. 以 Phosphate buffered saline （PBS） 洗滌細(xì)胞一至二次
   3. 加入 trypsin-EDTA溶液，于 37 oC 下作用 2~20 分鐘，使細(xì)胞可自培養(yǎng)瓶/皿中脫落
   4. 加入含有血清的新鮮培養(yǎng)基中，以終止胰蛋白酶作用
   5. 將脫落的細(xì)胞及其團(tuán)塊打散、混合均勻后，收集所有液體
   6. 離心后移除上清液，并添加新鮮培養(yǎng)基，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶/皿中進(jìn)行培養(yǎng)

   b. 懸浮型細(xì)胞 （suspension cell），又稱(chēng)懸浮培養(yǎng) （suspension culture）

   1. 將細(xì)胞培養(yǎng)液以 1000 rpm 離心 5 分鐘后，吸除上清液
   2. 加入適量新鮮培養(yǎng)基，與沉淀細(xì)胞混合均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶/皿中進(jìn)行培養(yǎng)。
4. 冷凍細(xì)胞 （cryopreservation）：獲得目標(biāo)細(xì)胞株后，將細(xì)胞懸浮于含有 5~10 % DMSO （二甲基亞砜，dimethyl sulfoxide） 及 30~50% FBS （胎牛血清，F(xiàn)etal Bovine Serum） 的新鮮培養(yǎng)液中，以 -80 oC 或液態(tài)氮等低溫設(shè)備保存。
5. 細(xì)胞計(jì)數(shù) （cell counting）：用以計(jì)算細(xì)胞濃度，可利用傳統(tǒng)血球計(jì)數(shù)器 （Neubauer chamber） 或自動(dòng)計(jì)數(shù)器 ，計(jì)算細(xì)胞濃度可用來(lái)判斷目前細(xì)胞生長(zhǎng)的情況。

廢液抽吸方法的比較

廢液抽吸目前有多種方法可以進(jìn)行。 早期實(shí)驗(yàn)室多利用移液器（pipette）或電動(dòng)吸管抽吸廢液，然而因?yàn)樾枰貜?fù)抽吸及排除液體，長(zhǎng)時(shí)間使用下來(lái)易造成手部不適及疲勞。 除此之外，電動(dòng)吸管須搭配無(wú)菌刻度吸管使用，而現(xiàn)多使用拋棄式吸管排除污染疑慮，因此一次實(shí)驗(yàn)下來(lái)通常會(huì)產(chǎn)生大量廢棄物，造成環(huán)境負(fù)擔(dān)。
現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室則普遍會(huì)自行購(gòu)置真空泵搭配真空瓶自行組裝，如此會(huì)較電動(dòng)吸管有效率，且設(shè)備取得較容易，然而自組式系統(tǒng)常見(jiàn)許多例如：管線(xiàn)配置不良，造成工作環(huán)境混亂、或是玻璃吸管經(jīng)常破裂等安全性上的缺點(diǎn)。

Lafil 廢液抽吸系統(tǒng)及 BioDolphin 廢液抽吸套件主要為生命科學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)過(guò)程中溶液抽吸應(yīng)用，可直接放置于無(wú)菌無(wú)塵作臺(tái) （laminar flow） 使用。 Lafil 廢液抽吸系統(tǒng)整合真空源、真空瓶與廢液抽吸套件，提供實(shí)驗(yàn)室一體化解決方案，更比傳統(tǒng)廢液抽吸系統(tǒng)減少一半臺(tái)面占用面積，并使用圍籬式平臺(tái)固定真空瓶，避免作者不小心碰觸瓶身而傾倒。
洛科Lafil 廢液抽吸系統(tǒng)及 BioDolphin 廢液抽吸套件

細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)設(shè)備

廢液處理與廢棄辦法

含有危險(xiǎn)化學(xué)品（如氯）之有機(jī)廢液應(yīng)收集至設(shè)有適當(dāng)標(biāo)示之專(zhuān)用廢液桶，不含危險(xiǎn)化學(xué)品之其它廢液可一并收集于一般混合廢液桶，廢油則需收集于廢油桶中。 細(xì)胞培養(yǎng)用的廢液應(yīng)加入適當(dāng)濃度的消毒劑，如漂白水（次氯酸鈉Sodium Hypochlorite），使細(xì)胞致死，再倒入水槽或廢液桶。 培養(yǎng)皿等生物醫(yī)療相關(guān)廢棄物則應(yīng)置于生物醫(yī)療廢棄物袋中，進(jìn)行高溫高壓滅菌后以一般廢棄物丟棄，或是請(qǐng)依照我國(guó)生物醫(yī)療廢棄物相關(guān)規(guī)定處理。

參考資料

• Cell Culture Basics: Equipment, Fundamentals and Protocols | Technology Networks
• Cell Culture Basics, EU (vanderbilt.edu)
• Cell Culture Fundamentals: Safety Aspects of Cell Culture, Sigma-Aldrich
• Cell culture protocol, Proteintech
• Cell culture | 細(xì)胞培養(yǎng)，ACE Biolabs
• Laboratory Environmental Sample Disposal Information Document, Section 6.0, 2010, US EPA
• TISSUE CULTURE WASTE DISPOSAL GUIDELINES, 2017, Laboratory Safety, THE GEORGE WASHINGTON UNIVERSITY
• Tissue Culture Waste Disposal Guide, 2022, EHS, Weill Cornell Medicine
• 行政院環(huán)境保護(hù)署，事業(yè)廢棄物貯存清除處理方法及設(shè)施標(biāo)準(zhǔn)，環(huán)署循字第 1111016706號(hào)
• 細(xì)胞繼代培養(yǎng)，生物資源保存及研究中心-BCRC小教室